㈠ 免疫組化注意事項
1、 標本的固定
組織標本及時的取材和固定是做好免疫組化染色的關鍵第一步，是有效防止組織自溶壞死，抗原丟失的開始。離體組織應盡快的進行取材固定，最好20分鍾內，因為有些抗原若固定不及時可能就檢測不到了。而對於固定液的選擇，原則上講，應根據抗原的耐受性來選擇相應的固定液，但在病理常規工作中很難做到這一點，因為病理的診斷和鑒別診斷都是在常規HE病理診斷的基礎上決定是否進行免疫組化的染色，而HE染色的常規組織處理是採用10%的中性緩沖福爾馬林或4%緩沖多聚甲醛進行組織固定，利用其滲透性強，對組織的作用均勻進行固定。組織固定時間最好在6-24小時內，一般組織固定時間不應超過24小時，隨著固定時間的延長對組織抗原的檢出強度將逐漸降低。另外，非中性福爾馬林緩沖液、含酸和含汞固定液亦可導致標記失敗或減弱。
2、 蠟塊的選擇
正確選擇用於免疫組化的蠟塊也是確保染色質量的關鍵因素之一。很多病例的組織蠟塊不止一個，不同的蠟塊中，組織成分常常並不完全一樣，一般選擇最具代表腫瘤特異性的蠟塊，最好含有內對照。更值得注意的是，所選取的蠟塊除了要包含代表腫瘤特異性的組織外，應盡量避免含有出血、壞死和脂肪組織。這些組織內的抗原大多已被破壞或丟失，最終通常呈片狀彌漫染色，除影響製片的美觀外，容易導致誤判或誤診。而且這些組織通常影響切片的質量。另外，最好不要選擇冰凍剩餘組織或脫鈣組織，冰凍或脫鈣一般也會影響組織內的抗原。
3、 修復方法的選擇和對比
抗原修復是指石蠟切片免疫組化染色前用酶、表面活性劑或微波、金屬鹽等對被掩蓋的抗原決定簇或變性的抗原進行暴露和修復，使抗原性得到一定程度的恢復過程。修復的方法有酶（胰酶、蛋白酶等）消化、加熱法（水浴、微波和高壓煮沸等）和超聲處理等，或者綜合利用以上方法。目前最常用的是加熱煮沸法，少數用酶消化法。大量實驗表明，固定時間越長的標本，所形成的交聯就越緊密，抗原就越難以被激活，所需的修復強度也就越強。各種修復方法染色強度的比較為：高壓法>水浴法>微波法。在日常工作中，要根據不同抗原的特性選擇合適的修復方法。抗原修復液常用的有枸櫞酸緩沖液（pH 6.0）、EDTA緩沖液（pH 8.0～9.0）等。修復液的PH值對染色結果也會產生相當大的影響。研究發現在高PH值約pH8.0～9.0時，都有較好的染色結果，所以目前比較推崇的抗原修復液為高PH值的修復液，尤其是對核陽性的抗體。
4、 確定陽性對照
免疫組化染色過程比較復雜、影響因素也很多，故應設置陽性對照和陰性對照。尤其是陽性對照尤為重要。陽性對照包括兩種，一種為內對照，這是一種比較理想的對照，對照和測試組織都在同一張切片中，都處於相同的實驗條件下，結果更可靠也更具有可比性。另一種稱為外對照，有時在測試的切片中不存在已知的抗原，如在胃的標本中懷疑是惡性黑色素瘤，在正常的胃組織中本身不存在相關的抗原，如果病變出現陽性反應結果，尚能提示是惡黑，但是如果出現陰性結果，就無法確定是本身組織中不含黑色素瘤抗原，還是技術問題。因此，應另外設立一個已知的陽性對照。另外，比較簡單的方法，是採用闌尾作為陽性對照。闌尾包含的組織種類較多，如有上皮、淋巴組織、平滑肌、間質、神經、血管、間皮等。因此，一張闌尾切片可以檢測大多數常用的抗體。
㈡ 免疫組化抗原熱修復的技術要點有哪些拜託各位大神
樓主你好： 第二節 免疫組化抗原熱修復的技術要點（供參考） 1、 抗原熱修復溫度和時間的關系 我們日常工作中所使用的組織固定液福爾馬林會引起組織蛋白內或蛋白之間的亞甲基發生橋連，具體過程如下： 第一步基本反應福爾馬林和氫反應形成新的化合物 第二步基本反應福爾馬林和氫反應形成新的亞甲基橋 上述反應的結果導致許多抗原決定簇被封閉，而加熱可以水解該橋連使抗原被激活。影響抗原熱修復的兩個最關鍵的因素是溫度和時間，有人將這兩種因素對抗原修復的影響總結為下面的公式： 抗原熱修復的有效性=加熱溫度（T） × 加熱時間（t） 也就是說當我們修復時的溫度越低則需要修復的時間就越長；反過來當修復溫度增高時修復的時間可以適當地縮短，才能使抗原決定簇完全暴露，這種反比的關系從MBI單克隆抗體的實驗結果表1中也可以清楚地看出。時間和溫度對染色的影響 時間（分鍾） 100℃ 80℃ 60℃5×2 + + + ――5×6 + + + + + + + ―5×10 ― + + + + +10小時 ―― + + 如果修復強度不夠，免疫組織化學染色所顯示的只能是修復後暴露的部分抗原決定簇，而不是組織所含的全部抗原。 這樣的染色結果可能會非常弱，或出現假陰性，即使是陽性結果，充其量只能起到定性的作用，不能適應今後對免疫組化進行定量的需要。這就給我們診斷中定量指標的應用帶來困難，例如用來測定耐葯的指標。更多質量檢測、分析測試、化學計量、標准物質相關技術資料請參考國家標准物質臨床化學標准物質 http://www.rmhot.com/plist_1/plist_1_15_0_1.html 2、組織固定時間和所需的抗原熱修復的關系 大量的實驗表明，固定時間越長的標本，它所形成的橋連就越緊密，抗原就越難以被激活，所需要的修復強度也就越強。有意思的是隨著固定時間的延長，組織中蛋白對溫度的耐受也相應增高（如圖1所示），這可能就是我們對固定時間長的標本加大修復強度的理論基礎。固定時間和變性的關系 這就提醒我們在做回顧性的研究時一定要注意所使用的修復條件，它與新鮮標本的修復條件一定是有所區別的，同等條件下一定要加長修復的時間或提高修復所使用的溫度，才可能得到比較滿意的結果。 3、 不同PH值抗原修復液對染色結果的影響 抗原熱修復中所使用的修復液PH值也會對染色結果產生相當大的影響。PH值對染色結果的影響大概可以分為以下四種情況。A―穩定型，PH值對染色結果影響不大，如PCNA、AE1、EMA、CD20等。B―V型，高PH值和低PH值染色較好，而PH值4-5染色結果較差，如ER、Ki-67等。C―上升型，隨著PH值的增加，染色結果逐漸增強，如HMB45等。D―下降型，隨著PH值的增加染色結果逐漸減弱，當然這種類型的抗體只是個別的現象，如MOC31。 一個有趣的現象值得注意，即在高PH值都有較好的染色結果，所以目前比較推崇的抗原修復液為高PH值得修復液，如1mMEDTA, PH8.0或PH9.0等。但是由於傳統習慣，絕大多數醫院和實驗室都在使用PH6.0的枸櫞酸緩沖液。綜合以上各種抗體的染色狀況，考慮到臨床工作的實際情況，許多國外免疫組化專家建議，在常規的免疫組化工作中，全部選用高PH值得修復液來代替目前廣為使用的PH6.0枸櫞酸緩沖液。為此，本公司已經推出PH8.0和PH9.0的新型抗原修復液。經驗證，絕大多數的抗體使用PH9.0得修復液效果都要優於PH6.0的枸櫞酸，尤其是核陽性的抗體。所以，在常規的免疫組化工作中，使用高PH值的抗原修復液是今後的必然趨勢。 4、抗原熱修復的手段 微波爐修復和高壓鍋修復的比較 溫度 壓力 v時間 受熱微波爐 100℃ 1P 15~20分鍾 不均勻高壓鍋 120℃ 1.2P 噴氣2分鍾 均勻 目前抗原熱修復所採用的方法主要有微波爐修復和高壓鍋修復兩種，從表中可以看出，由於高壓鍋修復具有溫度均一、節省時間、效果穩定等特點，已經越來越受到人們的青睞。
㈢ 2022-03-11
1.取材：用鋒利的刀片切取材料。
2.固定：將已切好的材料放入10%的福爾馬林溶液(即10%甲醛或者4%PFA in 1xPBS)中固定12-24小時。固定劑一般為組織塊體積的10-15倍。
3.放入全封閉式脫水機中（由於是皮膚組織不用洗滌直接放入脫水機中）。脫水機可以進行酒精脫水，透明和透蠟這三步。
酒精脫水：一般經50%、70%、85%、95%直至純酒精。每級停留約30分鍾至1小時。如需過夜，應停留在70%酒精中。
透明：材料先在純酒精和二甲苯各半的混合液浸15—30分鍾，再轉入純二甲苯中透明（至透明為止），一般15—30分鍾。
透蠟：材料自二甲苯中取出後,先移入二甲苯和石蠟等量的混合液中約30分鍾，然後進入純石蠟中約40—60分鍾，再換純石蠟一次約40—60分鍾。
4.自動包埋機中包埋樣本。
5.切片並貼片。(切5um)
6.染色的一般方法
由於要染的切片包在石蠟之中，而所用的染色劑又常常為水溶液，因此在染色之前，必須再度復水，石蠟切片在二甲苯中溶去石蠟，經過各級酒精，下降至水，經染色後需再脫水，上升到二甲苯透明然後封藏。
脫蠟至水
7.二甲苯脫蠟5-10min（建議10min）。
8.二甲苯與純酒精等量混液5min。
9.純酒精，95%、85%、70%、50%酒精各2min。
10.蒸餾水5min(置於搖床上)，2次。
（此步驟直接HE的蘇木精染色及後面步驟，具體見HE染色方案，或者接下面的免疫染色）
抗原修復
11.二甲苯中浸泡2次，每次20min.
12.分別在100%，95%，80%，60%的乙醇中浸泡，每種5min。
13.ddH2O中浸泡3次，每次1min.
14.浸入抗原修復液中（Tris-EDTA,PH9）,微波爐中中火10min.室溫自然冷卻35min。抗原修復液不可交叉使用。抗原修復液種類根據要驗證的蛋白類型來選擇。膜蛋白和胞質蛋白所推薦修復液不一樣。
15.1XTBS 洗三次，每次5min。
16.封閉液（5% goat serum in 1xPBS，封閉血清不能與二抗來源一致）室溫封閉1h.
17.一抗(用1xTBS稀釋)室溫2h(要放在濕盒中防止幹掉)或者4℃過夜。抗體現配現用，且不要反復凍融。
抗原修復也可以採用這個方法：這是我從一個有長期石蠟切片免疫染色經驗的實驗室的師姐那裡求來的。她說他們一直用這個方法，挺好用的，可以一試。
檸檬酸：Citric acid 品牌：sigma anhydrous, cell culture tested, plant cell culture tested Catalog #: C2404-100G
檸檬酸鈉：二水合檸檬酸三鈉Sodium citrate tribasic dihydrate ACS reagent, >= 99.0% 品牌：sigma Catalog #: S4641-500G
檸檬酸（100mM）：500 ml ddH2O + 9.6 g 檸檬酸
檸檬酸鈉（100mM）：500 ml ddH2O + 14.7g 檸檬酸鈉
檸檬酸鈉修復液（200ml）：3.8 ml 檸檬酸（100mM）+ 16.2 ml 檸檬酸鈉（100mM）+ 180 ml ddH2O
配製檸檬酸鈉修復液（200ml）：3.8 ml 檸檬酸（100mM）+ 16.2 ml 檸檬酸鈉（100mM）加ddH2O定量至200 ml。
抗原修復：檸檬酸鈉修復液浸泡，置於58℃烘箱內過夜（12-16h）。
㈣ 抗原修復液怎麼選擇
PBS是磷酸鹽緩沖液，主要組成成分為NaH2PO4.2H2O和Na2HPO4.12H2O及NaCl或KCl。使用濃度一般為0.1M和0.01M，PH7.2-7.5，做免疫組化一般多使用此緩沖液。根據配方配製即可，沒有聽說過用PBS作為抗原修復液的。 TBS是Tris(三羥甲基氨基甲烷)鹽緩沖液，主要組成成分為100mMTris.Cl (PH7.5)和0.9%(W/V)NaCl，做WB一般多使用此緩沖液。石蠟切片免疫組化比較難表達的抗原有時也用此緩沖液進行修復。
㈤ 抗原修復的作好免疫組化染色必須注意的問題
I、為達到免疫組織化學技術的要求，組織固定越新鮮越好。
在免疫組化最後結果的判斷時，常可見到均勻一片的似非特異性染色的現象，經多方研究認為，它是一種假性非特異性的染色。因為腫瘤組織中含有的抗原較易發生擴散彌散，腫瘤細胞無限制的生長和生長過速，導致腫瘤中間部分組織血液供給困難，造成缺血壞死，壞死細胞中的抗原由於機體的作用，可以被均勻地散布於細胞與細胞間的間質，這是抗原發生彌散的一種方式。另一種抗原彌散的方式就是，由於組織沒有及時的固定所引起的。離體的組織不及時固定，組織就會自溶，抗原就會擴散，這是一非常普通的常識，但要做好卻是極不容易。標本從外科切除到浸入固定液需要經過一段時間，在這段時間里，有的抗原就可以發生擴散。雖然已浸入了固定液，但標本較大，固定液的量又不足，當然由於固定液的滲透需要時間，當滲入到組織之中時，中間的細胞已發生了變化，抗原也隨著發生擴散，這種現象在產酶多的器官是比較明顯的，如胃癌，當切除後標本較大，雖然在手術室期間已放入了固定液，但固定液要透過肌層達到胃粘膜面起碼需要幾個小時的時間，當固定液發揮作用時，組織已經發生變化。因此，這了達到免疫組織化學染色的要求，對於離體的組織盡量快的進行固定，有條件的應將其剖開，早取材，早固定。
II、組織脫水必須徹底干凈
組織塊取材不能太大過厚，才能較好地完成脫水的過程。如果取材太厚，在較短的時間內脫水不完全，將可引起一系列的問題，比如浸蠟不徹底，切片不好完成，切不完整。由於先天不足，導致後來切片染色的脫落，造成染色的失敗，或者由此反復操作，造成人力物力的浪費，造成病理報告的延期發出等。因此，對取材的要求是除了要求要有藝術性外，即平整、外觀好看，還要求適中。
III、切片必須完整、均勻、平展、無鄒折、
應用於免疫組織化學染色的切片，對切片的質量要求較高，切片必須完整，平展、無汽泡，無鄒折，這樣有利在染色時的沖洗，有利於切片的牢固附貼。如果切片不平展，免疫組化染色後，可出現染色不均勻的現象，顏色深淺不一，不平。如果切片有汽泡切片在烘烤時，由於汽泡的破裂影響了汽泡周圍的組織，在其周圍可觀察到深淺不一的染色。如果切片有鄒折，免疫組化染色後，在鄒折的地方有深淺不一的顏色，這是一種假陽性，容易引起混淆。
IV、切片的附貼必須牢固，必須使用合適的粘貼劑。
免疫組織化學染色前的前期准備工作，就是必須對新的載玻片進行處理，新的載玻片表面看起來很乾凈，有人認為不需要進行任何的處理，都能夠適合使用，這是一種錯誤的想法。新出廠的載玻片，表面復蓋著開一層油脂樣的物質，如果不加以處理，對切片的附貼是極為不利的。我們的做法是：新的載玻片，放於玻璃清洗液中浸泡4小時甚至過夜，然後取出，經自來水徹底沖洗後，浸入酒精中達2小時以上，取出擦乾備用或烘乾也可。然後再將載玻片浸入了－氨基－三乙氧基－硅烷（3－Aminopropyl triethoxy-silane）的稀釋液（1：50用丙酮或無水乙醇稀釋都可以）中硅化10分鍾，後經無水乙醇洗2次，烘乾即可使用。
V、切片必須烘烤附貼牢固，既要經得起抗原修復時高溫的作用而不使輕易脫片，又不至於破壞抗原。
應用於免疫組化染色的切片。由於整個過程需經幾個階段的處理，如抗原修復時抗原修復液的沸騰且需持續十幾分鍾，PBS的反復沖洗，有的甚至於4℃冰箱中孵育達十幾小時。因此，對切片的質量要求很高，尤其是切片的附貼程度。以往有人主張切片在60℃以下烘烤30-60分鍾即可按此進行結果是切片掉片嚴重，切片松動率佔100%。切片究竟烘烤多長時間才合適，既不脫片和適合各項要求，又不至於破壞抗原。幾組實驗[]診斷P173認為，切片在60℃的恆溫乾燥箱中烘烤2-5小時最為合適。這是因為：抗原可耐受如此的溫度，病理科一般使用的石蠟，其熔點在60℃左右，組織浸蠟時，浸蠟箱中的溫度，一般都調在65℃左右，組織在這樣溫度中要浸泡2小時以上，才能達到徹底地浸蠟。組織中的抗原已經受了65℃的溫度考驗，保存下來的抗原，都已具有耐熱性。另外，經上述時間烘烤出來的切片，附貼牢固，抗原保存好，染色成功率達100%，保證了病理診斷的及時性和准確性。
特需要注意的是，不管是應用於診斷的切片還是研究用的切片，烘烤後應盡快進行染色。如果切片切完後，遲遲不進行染色，存放於室溫中或工作冰箱中，切片中的抗原將會隨著時間的延長而逐漸消失，甚至出現假陰性。原則上是新鮮切片，即行染色，染多少張切多少張，這樣才能盡可能的保存表達更多的抗原。
VI、切片脫蠟必須干凈，否則將會影響免疫組化染色的最後結果。
蠟不溶於水，不與其它的臨床使用的抗體相融合。它只能靠特用的試劑，處理足夠的時間，才能將其除去。如果脫蠟不幹凈，少許蠟存留於切片上，將會引起許多弊病，如染色不均勻，陽性物時隱時現，真假難辨，背景染色增加等。為了解決上述的問題，切片在染色前必須徹底脫蠟，目前用於脫蠟的試劑主要是二甲苯，因它脫蠟力強，脫蠟時間較短。較受使用者的青睞。脫蠟的時間要根據季節，室溫和試劑的新鮮程度採用不同脫蠟時間。如果在夏天，室溫較高，脫蠟試劑也新鮮，則脫蠟時間不需很多，3-5分鍾就已足夠。如果在冬天，室溫較低，脫蠟試劑也較陳舊，則脫蠟時間需要延長，10-20分鍾或更長。總之，操作時應根據不同的季節，不同的室溫，不同的試劑來決定脫蠟的時間，原則上是要徹底，干凈，完全地脫去切片上的蠟。為了做到這一步，切片在脫蠟前的加溫將有助於完成上述的要求。比如：當天切的切片，燒烤2小時後進行染色，切片帶有溫度進行脫蠟這將可加速脫蠟的過程，如果預先切好烤好的切片，在染色前，還必須對切片進行加溫10-20分鍾，然後再行脫蠟，這樣脫蠟速度加快，效果也會更好。
VII、必須徹底抑制內源性過氧化物酶的活性，才能降低背景的染色。
在各種組織中都含有很多的內源性過氧化物酶，尤其在紅細胞，中性粒細胞，單核細胞嗜酸性細胞，出血的組織壞死的組織等等。含有這種酶的各細胞和組織如果在染色前不對其進行處理和抑制，它們將會在DAB底物的顯色時，與HRP一樣催化底樣，使之顯色，使之生成與陽性物一樣的黃棕色，造成混亂。為止，在免疫組化染色前，都必須對內源性過氧化物酶進行抑制。當然，對它們進行徹底的消除是不行的，因為抑制太厲害，對抗原也會有相同的抑製作用。氫在抑制內源性過氧化物酶時，也要注意對抗原的保護，抑制也只能針對它們中的大部分，在DAB顯色後，顯示出淡黃色，這就足以與真正陽性物區別。抑制劑常用的是0.3%的H2O2，也可將其稱為1%H2O2，因為市售的H2O2的濃度為30%，按其凈含量則為0.3%，如果按其溶液的用量則為1%。
關於H2O2的使用，有的使用是單純的H2O2稀釋溶，有的使用是H2O2甲醇混合物。根據實驗，認為H2O2甲醇較適合於大多數的情況，因為除了H2O2外，甲醇對各種酶，都有鈍化的作用，因此H2O2甲醇的雙重作用效果較好。陳尚平等認為在多數情況中，用甲醇H2O2已經獲得令人滿意的結果。
VIII、須適當合理地使用封閉試劑
為了減少背景產生的非特異性染色，在免疫組化染色的過程中，在加入一抗孵育前，常常加入非免疫動物血清，以減少背景的染色，陳尚季等認為：抗體是高度的電荷分子，可能與帶有相應電荷的組織成分無特異性地結合（如膠原）。由於這種非特異性結合，將導致標記的部分局部化（軛合物）和膠原的假陽性染色。要用一種不相乾的抗體居先處理，可能減少和標記的抗體無特異性結合。
以往，血清的使用有很多，如：小牛血清，馬血清，山羊血清，綿羊血清，兔血清，濃度也有很多種，如：1%.2%.或1：5、1：10、和1:20.
必須選擇合適的抗體以及對作適當的保存和配製。
VVI、選擇合適的抗體
至今為止，應用於臨床的常用抗體有幾十種，在這當中又可分為兩種類型。
㈥ 何為抗原修復法
由於甲醛使蛋白質發生交聯，在氨基酸分子間形成亞甲基橋從而造成大部分抗原結合位點（抗原決定族）封閉。1991年Shi發現在酸鹼溶液中煮沸組織切片能夠改變甲醛的固定效應，使交聯打開，稱為抗原修復技術，從而擺脫了大批抗體只適用於冰凍切片的局限，使免疫組化進入了廣泛使用的進程。各種研究證明：對於絕大多數抗體，抗原修復技術優於酶消化法，抗原修復技術的效果取決於加熱的溫度、時間和抗原修復液的酸鹼度。