㈠ 免疫组化注意事项
1、 标本的固定
组织标本及时的取材和固定是做好免疫组化染色的关键第一步，是有效防止组织自溶坏死，抗原丢失的开始。离体组织应尽快的进行取材固定，最好20分钟内，因为有些抗原若固定不及时可能就检测不到了。而对于固定液的选择，原则上讲，应根据抗原的耐受性来选择相应的固定液，但在病理常规工作中很难做到这一点，因为病理的诊断和鉴别诊断都是在常规HE病理诊断的基础上决定是否进行免疫组化的染色，而HE染色的常规组织处理是采用10%的中性缓冲福尔马林或4%缓冲多聚甲醛进行组织固定，利用其渗透性强，对组织的作用均匀进行固定。组织固定时间最好在6-24小时内，一般组织固定时间不应超过24小时，随着固定时间的延长对组织抗原的检出强度将逐渐降低。另外，非中性福尔马林缓冲液、含酸和含汞固定液亦可导致标记失败或减弱。
2、 蜡块的选择
正确选择用于免疫组化的蜡块也是确保染色质量的关键因素之一。很多病例的组织蜡块不止一个，不同的蜡块中，组织成分常常并不完全一样，一般选择最具代表肿瘤特异性的蜡块，最好含有内对照。更值得注意的是，所选取的蜡块除了要包含代表肿瘤特异性的组织外，应尽量避免含有出血、坏死和脂肪组织。这些组织内的抗原大多已被破坏或丢失，最终通常呈片状弥漫染色，除影响制片的美观外，容易导致误判或误诊。而且这些组织通常影响切片的质量。另外，最好不要选择冰冻剩余组织或脱钙组织，冰冻或脱钙一般也会影响组织内的抗原。
3、 修复方法的选择和对比
抗原修复是指石蜡切片免疫组化染色前用酶、表面活性剂或微波、金属盐等对被掩盖的抗原决定簇或变性的抗原进行暴露和修复，使抗原性得到一定程度的恢复过程。修复的方法有酶（胰酶、蛋白酶等）消化、加热法（水浴、微波和高压煮沸等）和超声处理等，或者综合利用以上方法。目前最常用的是加热煮沸法，少数用酶消化法。大量实验表明，固定时间越长的标本，所形成的交联就越紧密，抗原就越难以被激活，所需的修复强度也就越强。各种修复方法染色强度的比较为：高压法>水浴法>微波法。在日常工作中，要根据不同抗原的特性选择合适的修复方法。抗原修复液常用的有枸橼酸缓冲液（pH 6.0）、EDTA缓冲液（pH 8.0～9.0）等。修复液的PH值对染色结果也会产生相当大的影响。研究发现在高PH值约pH8.0～9.0时，都有较好的染色结果，所以目前比较推崇的抗原修复液为高PH值的修复液，尤其是对核阳性的抗体。
4、 确定阳性对照
免疫组化染色过程比较复杂、影响因素也很多，故应设置阳性对照和阴性对照。尤其是阳性对照尤为重要。阳性对照包括两种，一种为内对照，这是一种比较理想的对照，对照和测试组织都在同一张切片中，都处于相同的实验条件下，结果更可靠也更具有可比性。另一种称为外对照，有时在测试的切片中不存在已知的抗原，如在胃的标本中怀疑是恶性黑色素瘤，在正常的胃组织中本身不存在相关的抗原，如果病变出现阳性反应结果，尚能提示是恶黑，但是如果出现阴性结果，就无法确定是本身组织中不含黑色素瘤抗原，还是技术问题。因此，应另外设立一个已知的阳性对照。另外，比较简单的方法，是采用阑尾作为阳性对照。阑尾包含的组织种类较多，如有上皮、淋巴组织、平滑肌、间质、神经、血管、间皮等。因此，一张阑尾切片可以检测大多数常用的抗体。
㈡ 免疫组化抗原热修复的技术要点有哪些拜托各位大神
楼主你好： 第二节 免疫组化抗原热修复的技术要点（供参考） 1、 抗原热修复温度和时间的关系 我们日常工作中所使用的组织固定液福尔马林会引起组织蛋白内或蛋白之间的亚甲基发生桥连，具体过程如下： 第一步基本反应福尔马林和氢反应形成新的化合物 第二步基本反应福尔马林和氢反应形成新的亚甲基桥 上述反应的结果导致许多抗原决定簇被封闭，而加热可以水解该桥连使抗原被激活。影响抗原热修复的两个最关键的因素是温度和时间，有人将这两种因素对抗原修复的影响总结为下面的公式： 抗原热修复的有效性=加热温度（T） × 加热时间（t） 也就是说当我们修复时的温度越低则需要修复的时间就越长；反过来当修复温度增高时修复的时间可以适当地缩短，才能使抗原决定簇完全暴露，这种反比的关系从MBI单克隆抗体的实验结果表1中也可以清楚地看出。时间和温度对染色的影响 时间（分钟） 100℃ 80℃ 60℃5×2 + + + ――5×6 + + + + + + + ―5×10 ― + + + + +10小时 ―― + + 如果修复强度不够，免疫组织化学染色所显示的只能是修复后暴露的部分抗原决定簇，而不是组织所含的全部抗原。 这样的染色结果可能会非常弱，或出现假阴性，即使是阳性结果，充其量只能起到定性的作用，不能适应今后对免疫组化进行定量的需要。这就给我们诊断中定量指标的应用带来困难，例如用来测定耐药的指标。更多质量检测、分析测试、化学计量、标准物质相关技术资料请参考国家标准物质临床化学标准物质 http://www.rmhot.com/plist_1/plist_1_15_0_1.html 2、组织固定时间和所需的抗原热修复的关系 大量的实验表明，固定时间越长的标本，它所形成的桥连就越紧密，抗原就越难以被激活，所需要的修复强度也就越强。有意思的是随着固定时间的延长，组织中蛋白对温度的耐受也相应增高（如图1所示），这可能就是我们对固定时间长的标本加大修复强度的理论基础。固定时间和变性的关系 这就提醒我们在做回顾性的研究时一定要注意所使用的修复条件，它与新鲜标本的修复条件一定是有所区别的，同等条件下一定要加长修复的时间或提高修复所使用的温度，才可能得到比较满意的结果。 3、 不同PH值抗原修复液对染色结果的影响 抗原热修复中所使用的修复液PH值也会对染色结果产生相当大的影响。PH值对染色结果的影响大概可以分为以下四种情况。A―稳定型，PH值对染色结果影响不大，如PCNA、AE1、EMA、CD20等。B―V型，高PH值和低PH值染色较好，而PH值4-5染色结果较差，如ER、Ki-67等。C―上升型，随着PH值的增加，染色结果逐渐增强，如HMB45等。D―下降型，随着PH值的增加染色结果逐渐减弱，当然这种类型的抗体只是个别的现象，如MOC31。 一个有趣的现象值得注意，即在高PH值都有较好的染色结果，所以目前比较推崇的抗原修复液为高PH值得修复液，如1mMEDTA, PH8.0或PH9.0等。但是由于传统习惯，绝大多数医院和实验室都在使用PH6.0的枸橼酸缓冲液。综合以上各种抗体的染色状况，考虑到临床工作的实际情况，许多国外免疫组化专家建议，在常规的免疫组化工作中，全部选用高PH值得修复液来代替目前广为使用的PH6.0枸橼酸缓冲液。为此，本公司已经推出PH8.0和PH9.0的新型抗原修复液。经验证，绝大多数的抗体使用PH9.0得修复液效果都要优于PH6.0的枸橼酸，尤其是核阳性的抗体。所以，在常规的免疫组化工作中，使用高PH值的抗原修复液是今后的必然趋势。 4、抗原热修复的手段 微波炉修复和高压锅修复的比较 温度 压力 v时间 受热微波炉 100℃ 1P 15~20分钟 不均匀高压锅 120℃ 1.2P 喷气2分钟 均匀 目前抗原热修复所采用的方法主要有微波炉修复和高压锅修复两种，从表中可以看出，由于高压锅修复具有温度均一、节省时间、效果稳定等特点，已经越来越受到人们的青睐。
㈢ 2022-03-11
1.取材：用锋利的刀片切取材料。
2.固定：将已切好的材料放入10%的福尔马林溶液(即10%甲醛或者4%PFA in 1xPBS)中固定12-24小时。固定剂一般为组织块体积的10-15倍。
3.放入全封闭式脱水机中（由于是皮肤组织不用洗涤直接放入脱水机中）。脱水机可以进行酒精脱水，透明和透蜡这三步。
酒精脱水：一般经50%、70%、85%、95%直至纯酒精。每级停留约30分钟至1小时。如需过夜，应停留在70%酒精中。
透明：材料先在纯酒精和二甲苯各半的混合液浸15—30分钟，再转入纯二甲苯中透明（至透明为止），一般15—30分钟。
透蜡：材料自二甲苯中取出后,先移入二甲苯和石蜡等量的混合液中约30分钟，然后进入纯石蜡中约40—60分钟，再换纯石蜡一次约40—60分钟。
4.自动包埋机中包埋样本。
5.切片并贴片。(切5um)
6.染色的一般方法
由于要染的切片包在石蜡之中，而所用的染色剂又常常为水溶液，因此在染色之前，必须再度复水，石蜡切片在二甲苯中溶去石蜡，经过各级酒精，下降至水，经染色后需再脱水，上升到二甲苯透明然后封藏。
脱蜡至水
7.二甲苯脱蜡5-10min（建议10min）。
8.二甲苯与纯酒精等量混液5min。
9.纯酒精，95%、85%、70%、50%酒精各2min。
10.蒸馏水5min(置于摇床上)，2次。
（此步骤直接HE的苏木精染色及后面步骤，具体见HE染色方案，或者接下面的免疫染色）
抗原修复
11.二甲苯中浸泡2次，每次20min.
12.分别在100%，95%，80%，60%的乙醇中浸泡，每种5min。
13.ddH2O中浸泡3次，每次1min.
14.浸入抗原修复液中（Tris-EDTA,PH9）,微波炉中中火10min.室温自然冷却35min。抗原修复液不可交叉使用。抗原修复液种类根据要验证的蛋白类型来选择。膜蛋白和胞质蛋白所推荐修复液不一样。
15.1XTBS 洗三次，每次5min。
16.封闭液（5% goat serum in 1xPBS，封闭血清不能与二抗来源一致）室温封闭1h.
17.一抗(用1xTBS稀释)室温2h(要放在湿盒中防止干掉)或者4℃过夜。抗体现配现用，且不要反复冻融。
抗原修复也可以采用这个方法：这是我从一个有长期石蜡切片免疫染色经验的实验室的师姐那里求来的。她说他们一直用这个方法，挺好用的，可以一试。
柠檬酸：Citric acid 品牌：sigma anhydrous, cell culture tested, plant cell culture tested Catalog #: C2404-100G
柠檬酸钠：二水合柠檬酸三钠Sodium citrate tribasic dihydrate ACS reagent, >= 99.0% 品牌：sigma Catalog #: S4641-500G
柠檬酸（100mM）：500 ml ddH2O + 9.6 g 柠檬酸
柠檬酸钠（100mM）：500 ml ddH2O + 14.7g 柠檬酸钠
柠檬酸钠修复液（200ml）：3.8 ml 柠檬酸（100mM）+ 16.2 ml 柠檬酸钠（100mM）+ 180 ml ddH2O
配制柠檬酸钠修复液（200ml）：3.8 ml 柠檬酸（100mM）+ 16.2 ml 柠檬酸钠（100mM）加ddH2O定量至200 ml。
抗原修复：柠檬酸钠修复液浸泡，置于58℃烘箱内过夜（12-16h）。
㈣ 抗原修复液怎么选择
PBS是磷酸盐缓冲液，主要组成成分为NaH2PO4.2H2O和Na2HPO4.12H2O及NaCl或KCl。使用浓度一般为0.1M和0.01M，PH7.2-7.5，做免疫组化一般多使用此缓冲液。根据配方配制即可，没有听说过用PBS作为抗原修复液的。 TBS是Tris(三羟甲基氨基甲烷)盐缓冲液，主要组成成分为100mMTris.Cl (PH7.5)和0.9%(W/V)NaCl，做WB一般多使用此缓冲液。石蜡切片免疫组化比较难表达的抗原有时也用此缓冲液进行修复。
㈤ 抗原修复的作好免疫组化染色必须注意的问题
I、为达到免疫组织化学技术的要求，组织固定越新鲜越好。
在免疫组化最后结果的判断时，常可见到均匀一片的似非特异性染色的现象，经多方研究认为，它是一种假性非特异性的染色。因为肿瘤组织中含有的抗原较易发生扩散弥散，肿瘤细胞无限制的生长和生长过速，导致肿瘤中间部分组织血液供给困难，造成缺血坏死，坏死细胞中的抗原由于机体的作用，可以被均匀地散布于细胞与细胞间的间质，这是抗原发生弥散的一种方式。另一种抗原弥散的方式就是，由于组织没有及时的固定所引起的。离体的组织不及时固定，组织就会自溶，抗原就会扩散，这是一非常普通的常识，但要做好却是极不容易。标本从外科切除到浸入固定液需要经过一段时间，在这段时间里，有的抗原就可以发生扩散。虽然已浸入了固定液，但标本较大，固定液的量又不足，当然由于固定液的渗透需要时间，当渗入到组织之中时，中间的细胞已发生了变化，抗原也随着发生扩散，这种现象在产酶多的器官是比较明显的，如胃癌，当切除后标本较大，虽然在手术室期间已放入了固定液，但固定液要透过肌层达到胃粘膜面起码需要几个小时的时间，当固定液发挥作用时，组织已经发生变化。因此，这了达到免疫组织化学染色的要求，对于离体的组织尽量快的进行固定，有条件的应将其剖开，早取材，早固定。
II、组织脱水必须彻底干净
组织块取材不能太大过厚，才能较好地完成脱水的过程。如果取材太厚，在较短的时间内脱水不完全，将可引起一系列的问题，比如浸蜡不彻底，切片不好完成，切不完整。由于先天不足，导致后来切片染色的脱落，造成染色的失败，或者由此反复操作，造成人力物力的浪费，造成病理报告的延期发出等。因此，对取材的要求是除了要求要有艺术性外，即平整、外观好看，还要求适中。
III、切片必须完整、均匀、平展、无邹折、
应用于免疫组织化学染色的切片，对切片的质量要求较高，切片必须完整，平展、无汽泡，无邹折，这样有利在染色时的冲洗，有利于切片的牢固附贴。如果切片不平展，免疫组化染色后，可出现染色不均匀的现象，颜色深浅不一，不平。如果切片有汽泡切片在烘烤时，由于汽泡的破裂影响了汽泡周围的组织，在其周围可观察到深浅不一的染色。如果切片有邹折，免疫组化染色后，在邹折的地方有深浅不一的颜色，这是一种假阳性，容易引起混淆。
IV、切片的附贴必须牢固，必须使用合适的粘贴剂。
免疫组织化学染色前的前期准备工作，就是必须对新的载玻片进行处理，新的载玻片表面看起来很干净，有人认为不需要进行任何的处理，都能够适合使用，这是一种错误的想法。新出厂的载玻片，表面复盖着开一层油脂样的物质，如果不加以处理，对切片的附贴是极为不利的。我们的做法是：新的载玻片，放于玻璃清洗液中浸泡4小时甚至过夜，然后取出，经自来水彻底冲洗后，浸入酒精中达2小时以上，取出擦干备用或烘干也可。然后再将载玻片浸入了－氨基－三乙氧基－硅烷（3－Aminopropyl triethoxy-silane）的稀释液（1：50用丙酮或无水乙醇稀释都可以）中硅化10分钟，后经无水乙醇洗2次，烘干即可使用。
V、切片必须烘烤附贴牢固，既要经得起抗原修复时高温的作用而不使轻易脱片，又不至于破坏抗原。
应用于免疫组化染色的切片。由于整个过程需经几个阶段的处理，如抗原修复时抗原修复液的沸腾且需持续十几分钟，PBS的反复冲洗，有的甚至于4℃冰箱中孵育达十几小时。因此，对切片的质量要求很高，尤其是切片的附贴程度。以往有人主张切片在60℃以下烘烤30-60分钟即可按此进行结果是切片掉片严重，切片松动率占100%。切片究竟烘烤多长时间才合适，既不脱片和适合各项要求，又不至于破坏抗原。几组实验[]诊断P173认为，切片在60℃的恒温干燥箱中烘烤2-5小时最为合适。这是因为：抗原可耐受如此的温度，病理科一般使用的石蜡，其熔点在60℃左右，组织浸蜡时，浸蜡箱中的温度，一般都调在65℃左右，组织在这样温度中要浸泡2小时以上，才能达到彻底地浸蜡。组织中的抗原已经受了65℃的温度考验，保存下来的抗原，都已具有耐热性。另外，经上述时间烘烤出来的切片，附贴牢固，抗原保存好，染色成功率达100%，保证了病理诊断的及时性和准确性。
特需要注意的是，不管是应用于诊断的切片还是研究用的切片，烘烤后应尽快进行染色。如果切片切完后，迟迟不进行染色，存放于室温中或工作冰箱中，切片中的抗原将会随着时间的延长而逐渐消失，甚至出现假阴性。原则上是新鲜切片，即行染色，染多少张切多少张，这样才能尽可能的保存表达更多的抗原。
VI、切片脱蜡必须干净，否则将会影响免疫组化染色的最后结果。
蜡不溶于水，不与其它的临床使用的抗体相融合。它只能靠特用的试剂，处理足够的时间，才能将其除去。如果脱蜡不干净，少许蜡存留于切片上，将会引起许多弊病，如染色不均匀，阳性物时隐时现，真假难辨，背景染色增加等。为了解决上述的问题，切片在染色前必须彻底脱蜡，目前用于脱蜡的试剂主要是二甲苯，因它脱蜡力强，脱蜡时间较短。较受使用者的青睐。脱蜡的时间要根据季节，室温和试剂的新鲜程度采用不同脱蜡时间。如果在夏天，室温较高，脱蜡试剂也新鲜，则脱蜡时间不需很多，3-5分钟就已足够。如果在冬天，室温较低，脱蜡试剂也较陈旧，则脱蜡时间需要延长，10-20分钟或更长。总之，操作时应根据不同的季节，不同的室温，不同的试剂来决定脱蜡的时间，原则上是要彻底，干净，完全地脱去切片上的蜡。为了做到这一步，切片在脱蜡前的加温将有助于完成上述的要求。比如：当天切的切片，烧烤2小时后进行染色，切片带有温度进行脱蜡这将可加速脱蜡的过程，如果预先切好烤好的切片，在染色前，还必须对切片进行加温10-20分钟，然后再行脱蜡，这样脱蜡速度加快，效果也会更好。
VII、必须彻底抑制内源性过氧化物酶的活性，才能降低背景的染色。
在各种组织中都含有很多的内源性过氧化物酶，尤其在红细胞，中性粒细胞，单核细胞嗜酸性细胞，出血的组织坏死的组织等等。含有这种酶的各细胞和组织如果在染色前不对其进行处理和抑制，它们将会在DAB底物的显色时，与HRP一样催化底样，使之显色，使之生成与阳性物一样的黄棕色，造成混乱。为止，在免疫组化染色前，都必须对内源性过氧化物酶进行抑制。当然，对它们进行彻底的消除是不行的，因为抑制太厉害，对抗原也会有相同的抑制作用。氢在抑制内源性过氧化物酶时，也要注意对抗原的保护，抑制也只能针对它们中的大部分，在DAB显色后，显示出淡黄色，这就足以与真正阳性物区别。抑制剂常用的是0.3%的H2O2，也可将其称为1%H2O2，因为市售的H2O2的浓度为30%，按其净含量则为0.3%，如果按其溶液的用量则为1%。
关于H2O2的使用，有的使用是单纯的H2O2稀释溶，有的使用是H2O2甲醇混合物。根据实验，认为H2O2甲醇较适合于大多数的情况，因为除了H2O2外，甲醇对各种酶，都有钝化的作用，因此H2O2甲醇的双重作用效果较好。陈尚平等认为在多数情况中，用甲醇H2O2已经获得令人满意的结果。
VIII、须适当合理地使用封闭试剂
为了减少背景产生的非特异性染色，在免疫组化染色的过程中，在加入一抗孵育前，常常加入非免疫动物血清，以减少背景的染色，陈尚季等认为：抗体是高度的电荷分子，可能与带有相应电荷的组织成分无特异性地结合（如胶原）。由于这种非特异性结合，将导致标记的部分局部化（轭合物）和胶原的假阳性染色。要用一种不相干的抗体居先处理，可能减少和标记的抗体无特异性结合。
以往，血清的使用有很多，如：小牛血清，马血清，山羊血清，绵羊血清，兔血清，浓度也有很多种，如：1%.2%.或1：5、1：10、和1:20.
必须选择合适的抗体以及对作适当的保存和配制。
VVI、选择合适的抗体
至今为止，应用于临床的常用抗体有几十种，在这当中又可分为两种类型。
㈥ 何为抗原修复法
由于甲醛使蛋白质发生交联，在氨基酸分子间形成亚甲基桥从而造成大部分抗原结合位点（抗原决定族）封闭。1991年Shi发现在酸碱溶液中煮沸组织切片能够改变甲醛的固定效应，使交联打开，称为抗原修复技术，从而摆脱了大批抗体只适用于冰冻切片的局限，使免疫组化进入了广泛使用的进程。各种研究证明：对于绝大多数抗体，抗原修复技术优于酶消化法，抗原修复技术的效果取决于加热的温度、时间和抗原修复液的酸碱度。