Ⅰ pcr实验步骤详细
一、 样品RNA的抽提
1. 取冻存已裂解的细胞，室温放置5分钟使其完全溶解。
2. 两相分离 每1 ml的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2 ml的，盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15秒后，15到30℃孵育2到3分钟。4℃下12 000 rpm离心15分钟。离心后混合液体将分为下层的红色酚相，中间层以及无色水相上层。RNA全部被分配于水相中。水相上层的体积大约是匀浆时加入的TRIZOL试剂的60%。
3. RNA沉淀 将水相上层转移到一干净无RNA酶的离心管中。加等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA，混匀后15到30℃孵育10分钟后，于4℃下12 000 rpm 离心10分钟。此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。
4. RNA清洗 移去上清液，每1 mlTRIZOL试剂裂解的样品中加入至少1 ml的75%乙醇（75%乙醇用DEPCH2O配制），清洗RNA沉淀。混匀后，4℃下7 000 rpm离心5分钟。
5. RNA干燥 小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室温空气中干燥5-10分钟。
6. 溶解RNA沉淀 溶解RNA时，先加入无RNA酶的水40μl用枪反复吹打几次，使其完全溶解，获得的RNA溶液保存于-80℃待用。
Ⅱ PCR模板为基因组DNA，一引物两侧有30bp反向互补序列，如何调整PCR程序
不在引物上，应该没啥问题。如果PCR产物特异性差，建议适当提高退火温度或者换用保真度高的酶。
如果非要认为模板特殊结构有影响的话，不妨试着调整一下PCR
缓冲液的成分，针对不同的结构有专用缓冲液。
祝楼主好运！
Ⅲ pcr仪使用时，在设定反应程序时，一共分了多少个步骤
1．常规程序
将PCR反应所需的成分配置完后，在PCR仪上于94-96℃预加热几十秒至几分钟，使模板DNA充分变性，然后进入扩增循环。在每一个循环中，先于94℃保持30秒钟使模板变性，然后将温度降到复性温度（一般50-60℃之间），一般保持30秒钟，使引物与模板充分退火；在72℃保持1分钟（扩增1kb片段），使引物在模板上延伸，合成DNA，完成一个循环。重复这样的循环25～35次，使扩增的DNA片段大量累积。最后，在72℃保持3-7min，使产物延伸完整，4℃保存。
2．复性（退火）和延伸温度
复性的温度是PCR扩增是否顺利的关键因素，通常在50-60℃之间。具体的温度主要由引物的Tm值决定。延伸温度绝大多数设定为72℃。如果复性的温度很高，可以将延伸温度和复性温度设置成同一温度，变成二步法PCR。
3．反应时间
变性步骤一般使用30秒钟，如果模板的G+C含量较高，或直接用细胞做模板，变性时间可适当延长。复性时间有30秒种一般是足够的。延伸时间由扩增产物的大小决定，一般采用1kb用1分钟来保证充足的时间。
4．循环次数
循环次数主要与模板的起始数量有关，在模板拷贝数为104～105数量级时，循环数通常为25～35次。
平台效应（plateaueffect）：PCR扩增过程后期会出现的产物的积累按减弱的指数速率增长的现象。原因：底物和引物的浓度已经降低，dNTP和DNA聚合酶的稳定性或活性降低，产生的焦磷酸会出现末端产物抑制作用，非特异性产物或引物的二聚体出现非特异性竞争作用，扩增产物自身复性，高浓度扩增产物变性不彻底。
5．PCR反应液的配制
PCR反应体系的配置方式有时也会影响反应的正常进行。常规方法与其它酶学反应一样，在最后加入DNA聚合酶。早期的PCR仪没有带加热的盖子，要求在反应液上覆盖一层矿物油，防止水分蒸发。
对于使用具3’-5’外切活性的高温DNA聚合酶时，有时会扩增不出产物。在遇到这个问题时，如果将反应成分分开配制，A管含模板、引物和dNTP，以及调整体积的H2O，B管含缓冲液、DNA聚合酶和水，然后再将两管溶液混合起来，可较好地克服这个问题。
按照常规的方法配制反应体系，有时会出现非特异性扩增的问题。热启动（hotstart）PCR操作方式可较好解决这一问题。将dNTP、缓冲液，Mg2+和primer先配制好，然后加入一粒蜡珠（如AmpliWaxPCRQam100），加热熔化，再冷却，使蜡将溶液封住，最后加入模板和DNA聚合酶等剩余成分。只有当PCR反应进入高温阶段后，蜡层熔化，所有反应成分才会混合在一起。
Ⅳ 简述PCR技术操作步骤
PCR即聚合酶链式反应（Polymerase chain reaction）的缩写，它是体外酶促合成特异DNA片段的方法。这一方法的要点是合成两个分别互补于待扩增DNA片段两端的小片段引物，在含有引物、待扩增DNA模板核苷酸底物和DNA多聚酶的反应体系中DNA复制反复进行，在短时间内可以取得大量扩增产物。其原理是寡聚核苷酸链引物在DNA聚合酶的作用下沿模板延伸，合成两个与靶DNA两侧序列互补的引物，在体外进行靶DNA的重复合成。
主要的技术步骤是：
（1）DNA变性 加热使靶DNA序列双链解离成单链DNA。
（2）引物与靶DNA退火 适当降低温度，使两个引物分别结合成靶DNA两条的3′末端向5′末端延伸。
（3）引物延伸 在DNA聚合酶的催化下，引物沿着靶DNA3′末端向5′末端延伸。新合成的DNA链在变性解离后，又可作为模板与引物杂交，并且在DNA聚合酶的催化下，引导合成新的靶DNA链。如此反复进行以上3个步骤，即可使靶DNA片段指数性扩增。
Ⅳ PCR引物GC含量过低时候,如何调整PCR体系
!gyesang(站内联系TA)你PCR的模板是什么?你做PCR的目的是什么?设计引物的时候,上下游引物的GC含量相差尽量 不要太大,你接下来可以试下touchdown.意孤城_(站内联系TA)如果不想麻烦就touchdown PCR,如果求稳当设置梯度PCR,温度上下限时你两条引物的温度cicelyzh(站内联系TA)一般GC含量低的话把引物序列设计稍微长一点,就可以补偿Tm低的问题.你说的百分比差别也不是那么大.如果两个引物的tm不同,按照低的考虑PCR的退火温度.加酶切位点的引物的Tm需要按照不包含酶切位点的序列计算.xikexiao(站内联系TA)GC含量最好在50%以上比较好,不然退火温度达不到,建议重新设计引物scilencing(站内联系TA)试试梯度PCR的策略
Ⅵ 两步法pcr程序设定
一步法,使用特殊引物,全程只设置一个温度即可完成扩增.这种特殊引物有专利.
二步法即循环扩增中设置2个步骤,这个方法主要扩增短片段,一个是95度变性,另一个是退火与扩增的温度,一般设置在55~60之间,当然也有例外.
三步法就是平常见到的方法,扩增循环有三步,变性,退火,延伸.
Ⅶ PCR配液过程中正确的操作是什么
PCR操作流程：
1. 从冰箱取出所需试剂、样品，放置在冰盒上，解冻试剂、样品，点动离心。 2. 取所需数量小EP管（200 μl），按附录所示配制反应体系。 3. 加完所有试剂和样品后，点动离心，去除管内气泡。 4. 在PCR仪上设定合适参数，具体见仪器操作手册。参数设置完成后，将反应管放入PCR仪内小EP管位，根据所用EP管调整热盖位置，盖紧上盖。 5. 启动程序，做好记录。 6. 完成后及时取出反应管，关闭仪器。 7. 用0.5×TBE配制琼脂糖胶，100 V，电泳15-25 min，紫外灯下观察条带，必要时拍照记录。 注意事项： 1. 节约试剂，所有试剂使用前都应点动离心；若为探索条件或鉴定试验，推荐25 μl反应体系。 2. 含酶试剂应尽量保持低温，从冰箱取出解冻后，应尽量放在冰盒里，每次吸完后也应放回冰盒。 3. 加试剂及样品应按顺序进行，模板应在最后加入；自加引物开始，每次吸样前都必须更换吸头。 4. 注意移液器正确使用，吸取或排出微量液体时，应注意保证吸取或加入量的准确性。 5. 加完所有试剂后去气泡应彻底。 6. 及时记录仪器使用及状况。 7. 琼脂糖胶浓度可根据目的条带大小做适当调整。
附：PCR常用反应体系 如所用试剂为Takara ExTaq/rTaq试剂，则反应体系如下（50 μl）： ddH2O 35.5/34.5 μl 10*Buffer 5 μl 2.5mM dNTPS 4 μl 引物1 2 μl 引物2 2 μl Taq酶 0.5 μl 模板 1/2 μl 如所用试剂为Mix则反应体系如下（50 μl）： ddH2O 20/19 μl 2*Mix 25 μl 引物1 2 μl 引物2 2 μl 模板 1/2 μl 注：反应体系可按比例调整；斜杠后的体系为菌液PCR体系；若使用Takara试剂，菌液PCR使用rTaq酶，其余样本使用ExTaq酶，反应中使用的其它试剂相同。
Ⅷ PCR的完整操作步骤是什么
首先在PCR仪中设定程序：一般是94度变性5min，之后“94度变性、退火（不同引物温度不同）、72度”延伸共30-35个循环，再72度延伸10min，最后hold16度即可。反应体系一般有20微升或50微升，由上下游引物、buffer、dNTP、模板、Taq酶和水等组成，配好后放入PCR仪中按设定程序进行即可。
Ⅸ PCR仪如何设置
1、按 PCR 仪正面左下角电源开关，启动 PCR 仪。
2、放 PCR 离心管，先把顶盖向上扳，再往前推，露出放样孔，PCR 管
放入前应加好反应体系各组分，再放入 PCR 离心管。
3、反向重复第二步骤将顶盖板向后拉，盖好顶盖。
4、按 F2“Create”新建一个扩增的 PCR 程序。
5、按控制台面右方上下左右方向键，可随意移动编辑位置，输入需要
的温度、时间、循环数等。
6、据 PCR 离心管中加入的反应体积总量，在“Reaction volume”后输入
相应数值，有 Std“1～100ul”和 9600“1~50ul”两档可供选择。
7、按 F1“Start”启动
8、按“INFO”对应键查看 PCR 结束键。
9、扩增完成后按台面左方“Stop”键退出。
10、按“Hist”，可查看上次扩增的历史记录。11、完全退出后，按台面左下方电源开关，拔出插销，切断电源。
Ⅹ 上海pcr从30调到40
1、首先打开上海pcr应用程序主页面。
2、在主页面找到并且点击pcr数值。
3、在弹出的页面点击更换数值。
4、将30调到40，点击确定即可。