⑴ 【求助/交流】信號通路如何研究
煙大考研(站內聯系TA)不懂，還是頂你一下henkally(站內聯系TA)LZ能做定量熒光PCR就做定量吧，定量的結果更能被大多數雜志接受。不過信號通路最好還是從蛋白層面進行，分析可能的4條信號通路，做相關蛋白的western blot，檢測下游蛋白常見的如磷酸化修飾silicare(站內聯系TA)信號通路太復雜了，還是文獻吧，當然是 diea了livee(站內聯系TA):tiger07:xuec(站內聯系TA)多看些英文文獻吧，很多有關報道的
看多了你就有思路了
所以還是勤奮點兒吧tongyanna(站內聯系TA)我還真不明白啊xp198766(站內聯系TA)幫LZ頂，最近我想也知道類似問題的答案，不知道有沒有高手會KEGG的，能不能寫一點總結出來啊……期待啊……lwiaanngg(站內聯系TA)如果你知道大概的途徑，可以用上面說的RT-PCR等手段
如果你不知道，你可以使用蛋白microarray/DNA microarray來測定相對變換量sqhnsd(站內聯系TA)先做相關的表型觀察，看看錶型符合那個通路相關的現象，然後做WB、蛋白質相互作用等試驗進一步去檢測具體的機制如何。但是如何去做，還必須通過看文獻才能幫助你解決問題。charlie9(站內聯系TA)信號通路的變化，一般與mRNA的變化關系不大。它一般通過關鍵蛋白分子的修飾有關，因此RT-PCR一般不能說明問題。Western-blots檢測被修飾的蛋白分子為好。
⑵ 如何在資料庫中查詢和某種疾病相關的信號通路
我覺得應該是將獲得的DNA序列通過BLAST與NCBI上的序列比對，獲得與目的DNA序列最相近的同源序列，根據同源序列的基因功能推斷此基因可能的功能。
⑶ 信號通路同時檢測磷酸化和非磷酸化的是什麼目的
從細胞膜、胞漿到細胞核，存在多條信號通路串聯交叉形成的復雜信號網路。該信號網路在細胞受到胞外刺激後將信號通過級聯放大、分散調節等方式傳入胞內，引起一系列的綜合性細胞應答。一種生物效應的出現往往存在多條信號通路的同步活化，可逆的磷酸化修飾反應則是細胞內部最為普遍和節能的信號蛋白活化調節方式。因此，找到激活的信號通路乃至發生磷酸化調變的通路蛋白，往往成生命科學研究的起點。
信號通路磷酸化抗體晶元針對每一個特定蛋白磷酸化位點，設置一對抗體分別檢測其磷酸化（Phospho）和非磷酸化（non-Phospho）狀態以提高磷酸化檢測靈敏度和穩定性，配對的磷酸化和非磷酸化的抗體使特定的位點上的磷酸化狀態的改變更加容易分析，可以在同一樣本內進行信號的比較，也可以比較樣本之間的磷酸化/非磷酸化信號比值的變化。一次晶元實驗即可實現多條信號通路的同步篩選和具體調變位點的清晰定位，為後續生物現象的深入探索提供明確的研究方向。
我從上海那個華盈生物網站看到的，啊，不會被和諧掉吧？
⑷ ras基因及信號通路
ras基因首先在Harvery鼠肉瘤病毒（Ha-MSV）和Kirsten鼠肉瘤病毒（Ki-MSV）的子代基因中被發現，在這種子代病毒中發現含有來源於 宿主細胞 的基因組的新基因序列，此後人們將這種宿主細胞基因稱為ras基因。
KRAS基因突變與肺癌、胰臟癌和大腸癌的發生有著密切的關系，52﹪的肺腺癌病人有KRAS基因的突變。台灣地區胰臟癌的病人的研究結果顯示，有高達90﹪突變率。
1982年Weinberg和Barbacid首先從人膀胱癌細胞系中分離出一種轉化基因，可使 NIH 3T3 細胞發生惡性轉化，而從正常人組織中提取的DNA則無此種作用。隨後，Santos與Parada發現上述轉化基因並非新型基因，而是Harvery鼠肉瘤病毒ras基因的人類同源基因，命名為H2ras。同年，Krontiris在人肺癌細胞中發現Kirsten鼠肉瘤病毒基因的同系物，稱為K-ras.另一種相似的基因是在人 神經母細胞瘤 DNA感染NIH3T3細胞時發現的與ras類似的基因，稱為N2ras，此種基因和病毒無關.
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ras基因 在進化中相當保守，廣泛存在於各種 真核生物 如哺乳類，果蠅，真菌，線蟲及酵母中，提示它有重要的生理功能.哺乳動物的ras基因家族有三個成員，分別是H-ras,K-ras,N-ras，其中K-ras的第四個外顯子有A,B兩種變異體.各種ras基因具有相似的結構，均由四個外顯子組成，分布於全長約30kb的DNA上.它們的編碼產物為 相對分子質量 2.1萬的蛋白質，故稱為P21蛋白.已證明，H-ras位於人類11號染色體短臂上（11p15.1～p15.3),K-ras位於12號染色體短臂上（12p1.1～pter),N-ras位於1號染色體短臂上（1p22-p32），除了K-ras第四個外顯子有變異外，每個ras基因編碼P21的序列都平均分配在四個外顯子上，而內含子的序列及大小相差很大，因而整個基因也相差很大，如人K-ras有35kb長，而N-ras長為3kb.由於有兩個第四號外顯子，K-ras可以兩種方式剪接，但編碼K-ras-B的mRNA含量高.除K-ras-B含有188個氨基酸外，其他兩種 Ras蛋白 均含有189個氨基酸.
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3.1 Ras蛋白的結構
Ras蛋白為膜結合型的GTP/GDP 結合蛋白 ， 相對分子質量 為2.1萬，定位於細胞膜內側.它由188或189個氨基酸組成，它的第一個結構域為含有85個 氨基酸殘基 的 高度保守序列 ，接下來含有80個氨基酸殘基的結構域中，Ras蛋白結構輕微不同，除了K2Ras末端25個氨基酸由於不同的外顯子而分為A型和B型外，其餘Ras家族成員最後四個氨基酸均為Cys1862A2A2X2COOH序列.Ras蛋白存在4種異構型：H2Ras,N2Ras,K2Ras4A和K2Ras4B，它們是3種基因的產物，其中K2Ras4A和K2Ras4B是同一基因不同剪接的結果.
3.2 Ras蛋白的功能
Ras(P21）蛋白位於細胞膜內側，它在 傳遞細胞 生長分化信號方面起重要作用.它屬於 三磷酸鳥苷 （GTP）結合蛋白（一種細胞信息傳遞的耦聯因子），通過GTP與 二磷酸鳥苷 （GDP）的相互轉化來調節信息的傳遞.P21與GTP和GDP有很強的親和性，而且有較弱的GTP酶活性.正常情況下P21和GDP結合處於失活狀態，當細胞外的生長分化因子把信號傳導到胞膜內側的P21時，可增強P21與GTP結合活性，使P21和GTP結合成為激活狀態，信號系統開放.因為P21有GTP酶活性，可使GTP水解成GDP,P21和GDP結合後P21失活，信號系統關閉.正常情況下P21的GTP酶活性很弱，當和 GTP酶激活蛋白 (GAP）結合後其水解速度可提高1萬倍而使P21失活.P21和GDP結合後可以激活鳥苷酸釋放蛋白（GNRP),GNRP使P21釋放GDP結合GTP，因此通過GTP和GDP的相互轉化可以有節制地調節P21對信號系統的開啟和關閉，完成生長分化信號傳入細胞內的過程.
Ras蛋白在合成後，需要經過兩種方式翻譯後修飾，才可定位於細胞膜內側.①通過FTase在Ras蛋白羧基端的CAAX四肽結構中的Cys殘基上加上一個類異戊二烯基團法尼基，隨後AAX殘基從C端上斷裂脫落，法尼基化Cys
羧甲基化，此修飾使RasC端具有疏水性；②N2或H2ras的 半胱氨酸 的S2醯基化，長鏈的S2醯基取代基使ras具有疏水性.有研究表明，激活ras的表達能增強血管生長因子（例如VEGF/VPF）的表達，提示Ras蛋白在 血管生成 中發揮作用，抑制Ras蛋白活性能抑制依賴Ras蛋白的腫瘤細胞增殖，也能幹擾血管生成.同時，激活Ras蛋白還能抑制凋亡.Ras蛋白過度表達還能增加葯物和紫外光誘導的凋亡，可能的機制是 ras癌基因 增強了細胞分解 過氧化氫 的能力從而抑制凋亡.然而，這個假說還需進一步研究.
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4.1 ras基因激活的方式
作為原癌基因的ras基因被激活以後就變成有致癌活性的癌基因.ras基因激活的方式有3種：基因點突變，基因大量表達，基因插入及轉位.其中ras基因被激活最常見的方式就是點突變，多發生在N端第12,13和61密碼子，其中又以第12密碼子突變最常見，而且多為GGT突變成GTT.不同突變位點對P21的活化機制不同，第12密碼子突變可以減弱P21內在的GTP酶活性，並使細胞凋亡減少，細胞間接觸抑制減弱；第61密碼子突變可削弱GAP對P21的內在GTP酶活性，並可減弱GAP與P21結合的穩定性.
4.2 ras基因突變致癌的機制
ras基因激活構成癌基因，其表達產物Ras蛋白發生構型改變，功能也隨之改變，與GDP的結合能力減弱，和GTP結合後不需外界生長信號的刺激便自身活化.此時Ras蛋白內在的GTP酶活性降低，或影響了GTP的活性，使Ras蛋白和GTP解離減少，失去了GTP與GDP的有節制的調節，活化狀態的Ras蛋白持續地激活PLC產生第二信使，造成細胞不可控制地增殖，惡變.同時細胞凋亡減少，細胞間接觸抑制增強也加速了這一過程.
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Ras2MAPK信號轉導途徑
5.1 Ras上游通路
Ras能被復雜的網路激活.首先，被磷酸化激活的受體如PDGFR,EGFR直接結合 生長因子受體 結合蛋白（Grb2），這些受體也可以間接結合並磷酸化含有src同源區2(SH2）結構域的蛋白質（例如Shc,Syp）後，再激活Grb2.第二，Grb2的src同源區3(SH3）結構域與靶蛋白如mSos1,mSos2,C3G及發動蛋白（dynamin）結合.C3G與連接蛋白Crk的SH3結構域結合後耦聯酪氨酸磷酸化而激活Ras.Crk也能結合mSos1激活Ras.Grb2與激活的受體結合促進鳥苷酸交換因子（Sos）蛋白定位在與Ras相鄰的細胞膜上.這樣，Sos與Ras形成復合體，GTP取代GDP與Ras結合後，Ras被激活，當GTP水解成GDP後Ras失活.Ras具有內在GTPase活性，它的活性可被RasGAPs調節，因而RasGAPs扮演Ras活性調節劑的角色.另外，Ras失活也受到高度調節。有三種蛋白質能水解GTP使Ras失活，它們分別是P120GAP,neurofibromin和GAP1m，統稱為RasGAPs.
5.2 Ras下游通路
5.2.1 Ras/Raf通路
至今，Ras/Raf通路是最明確的信號轉導通路.當GTP取代GDP與Ras結合，Ras被激活後，再激活絲蘇氨酸激酶級聯放大效應，招集細胞漿內Raf1絲蘇氨酸激酶至細胞膜上，Raf激酶磷酸化MAPK激（MAPKK),MAPKK激活MAPK.MAPK被激活後，轉至細胞核內，直接激活轉錄因子.另外，MAPK刺激Fos,Jun轉錄因子形成轉錄因子AP1，該因子與myc基因旁的特異的DNA序列結合，從而啟動轉錄.myc基因產物也是轉錄因子，它能激活其他基因.最終，這些信號集中起來誘導D型Cyclin的表達和活性.D型Cyclin與Cyclin依賴性激酶（如CDK4和CDK6）形成復合體，該復合體的形成促使細胞從G1期進入S期.因此，Ras/Raf通路在受體信號和G1期進展之間起著關鍵作用.然而，Ras/Raf通路不是調控G1期進展的惟一通路.Ras與Raf單獨結合不能促進Raf激酶活性，同時，Raf能被不依賴Ras的機制所激活（例如能被Src酪氨酸激酶和PKC所激活），MAPK也能被不依賴Ras機制（如通過調節整合素的活性）所激活.表明級聯反應每一個信號蛋白質都能被多個上游蛋白質所激活，而它們也可能有另外的靶蛋白.另一個重要的Ras通路效應物是Cyc2lin依賴性激酶抑制劑P21Waf1/cip1，它被Ras所誘導，抑制Cdk2CyclinE和Cdk2CyclinA復合體的活性，從而阻斷DNA的合成.
5.2.2 Rho/Rac通路
Rho家族蛋白質是 小G蛋白 的 Ras超家族 成員，其氨基酸序列大約有30%與Ras蛋白相同，三個主要的Rho蛋白是Cdc42,Rho,Rac.Cdc42刺激Rac,Rac接下來刺激Rho.然而，這個直線模型對於精確的信號轉導通路來說過於簡單，因為有證據顯示交叉聯系存在，例如Cdc42不通過Rac能影響Rho的活性.下游靶點Rho激酶α的激活，導致肌動蛋白的重新構建和P21激活的絲蘇氨基酸激酶參與應力纖維的分解.最後Rac和Cdc42利用MAPK傳遞信號至核內，Rho通過刺激Src和fos啟動子達到轉錄調節的作用.另外，Rac和Cdc42激活JunN端激酶，該酶結合Jun,EIk1和ATF2等轉錄因子，這就是Rho在細胞癌變過程中起重要作用的可能機制.另一個重要Rho下游靶點是P21Waf1/cip1.Rho抑制P21Waf1/cip1誘導，有利於Ras驅動細胞進入S期,P21Waf1/cip1陰性細胞不需要Rho進行Ras激活的DNA合成，降低了通過誘導P21Waf1/cip1在Ras轉化過程中的重要性.
5.3 Ras2MAPK信號途徑與腫瘤的關系
腫瘤發生 與調控 細胞增殖 的信號發生異常有關.一些腫瘤病人 生長因子 或其受體的表達或功能出現異常，如卵巢癌病人血清中EGF和 胰島素樣生長因子 含量升高；EGF增高影響細胞間連接，促進細胞轉移和浸潤.臨床資料表明， 酪氨酸蛋白激酶受體 過表達與腫瘤相關，ErbB22在乳癌病人中30%過表達；起源於上皮的肺癌，乳癌等EGFR過表達，並與高轉移率，低生存率以及差的預後相關，通過降低EGFR表達可抑制EGFR過表達的卵巢癌細胞的增殖.腫瘤細胞ras基因突變率大約為25%，而胰腺癌和結腸癌分別達到85%和40%. ras癌基因 主要以點突變和基因擴增方式存在，突變位點在第11,12,13,18,59,61密碼子，是Ras蛋白和GAP的作用位點，由於突變，抑制了Ras內在的GTP酶活性，突變的Ras鎖定在持續激活的Ras2GTP狀態，引起細胞的惡性轉化.raf癌基因與人類腫瘤關系密切，很少突變，但Raf持續活化，可導致細胞惡性轉化；在 小細胞肺癌 病人的組織標本中，Raf在mRNA和蛋白水平均過表達，活性增高.在腫瘤治療的研究中，可從以下幾方面阻斷Ras2MAPK 信號轉導途徑 ：① 酪氨酸蛋白激酶抑制劑 ，如Radici2col抑制V2Ha2ras轉化的NIH3T3細胞的MAPK活性，使細胞表型逆轉；新研究的酪氨酸蛋白激酶抑制劑能雙重作用ErbB22和EGFR，廣泛抑制ErbB22或（和）EGFR過表達的腫瘤生長.②抑制Ras法尼基化： 法尼基轉移酶抑制劑 （FTIs）是分子水平抗癌葯，抑制ras翻譯後修飾，已有多種FTIs用於動物模型和臨床前期實驗，有明顯的抗腫瘤作用，如SCH66336對表達高水平H2Ras2GTP和ras是否突變的腫瘤都有生長抑製作用，已進入臨床試驗.③反義核苷酸技術：C2H2ras 反義RNA 質粒降低人胃癌BGC2823細胞的H2ras表達並抑制細胞生長和部分惡性表型逆轉；Raf21反義DNA抑制人 白血病 細胞的增殖.④其他：針對 受體酪氨酸激酶 與底物作用的SH2區或SH3區設計多肽，在體外實驗抑制酶和底物結合.
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6.1 診斷
ras癌基因 和P21在許多癌前病變中都有表達.Ochi等發現1例胰液中K2ras突變 陽性 而細胞學及影像學檢查均陰性的病例，隨診18個月後才發現惡性細胞及影像學的變化.提示ras基因突變早於病理檢出及臨床表現的出現.提示可用檢測ras癌基因或P21的方法對癌變傾向提供較早信息.Kimura等檢測切除的胰腺標本中K2ras的突變率，在胰導管癌，胰黏液細胞癌和慢性胰腺炎中分別是81%,53%和7%，相應胰液中的突變率分別為72%,53%和0，所以檢測胰液中突變的K2ras基因即可為 臨床診斷 提供有力的幫助.Futakawa等檢測52例胰腺癌病人胰液中突變的K2ras基因和 癌胚抗原 水平，結果顯示這兩項指標聯合檢測在胰腺癌診斷中的准確度是90%，因此可用聯合檢測的方法及早而准確地診斷腫瘤.
6.2 病情評估及預後判斷
Shirakawa等通過檢測P21,P53,Ki67和 細胞角蛋白 10發現食管鱗癌的分化程度取決於發育不良的程度，而P21在這個演化過程中起關鍵作用.Rak等發現突變的ras基因可強效刺激 血管內皮細胞生長因子 的表達.Thebo等對有K2ras12或13密碼子突變的DukesB2期 結直腸癌 進行分析顯示，80%的原發灶和局域 淋巴結 發生相同位點的ras基因突變，說明ras基因突變對腫瘤 淋巴結轉移 是高風險因素.有文獻報道，唾液腺癌中H2ras基因突變率與臨床病理指標呈高度正相關，可通過檢測基因突變來推測腫瘤所處的階段和分化程度.可見檢測突變的ras基因可為臨床病情的評估提供有力的依據.
Harada等研究表明，P21(-）者5年生存率為64.1%,(+）者為38.0%，⑹者為11.5%,P21是決定生存率的重要而獨立的指標.但許多文獻報道ras基因突變和臨床病理指標及預後沒有明顯的關系.聯合檢測 非小細胞肺癌 組織中K2ras,p53和cerbB2基因的異常表達，比單項檢測可明顯地提高對預後的評估，因此，可用聯合檢測對某種腫瘤較敏感的幾個癌基因的方法來對預後進行評估.
6.3 治療
研究表明，體外給予結腸癌細胞（HCT116/P21+/+)P21 反義寡脫氧核苷酸 ，可提高癌細胞對放療的敏感性；用末端含CAAX鹼基的制劑作用於人類 ras癌基因 轉染的 動物細胞 ，可抑制癌細胞的生長；用核糖酶（K2rasR2）拮抗突變的K2ras12細胞系，可使細胞生長停止，凋亡增加，VEGF 基因表達 受抑.可見用分子生物學的方法治療腫瘤是有廣闊應用前景的.
總之，雖然對ras基因，Ras蛋白及Ras信號轉導通路的研究已達一定的深度，ras基因已在臨床有一些應用，但仍有許多問題需解決，如ras基因突變發生在腫瘤形成的那些階段，Ras信號轉導通路與其他信號轉導通路相互影響，相互交叉，阻斷單一信號轉導通路能否真正起到改變或影響 腫瘤發生 發展的作用等.隨著對這些問題的研究，解決，人們將對腫瘤的預防，診斷和治療提供更新更有效的方法.
Ras癌基因參與人類腫瘤的發生發展，最初是在急性轉化性逆轉錄病毒實驗中從Harvey、Kirsten兩株大鼠肉瘤病毒中克隆出來的轉化基因，自1982年Weinberg等人發現人的膀胱癌細胞中有活化的H-ras基因後，引起了人們對 ras癌基因 在人類腫瘤發生發展過程中所起的作用的極大關注。
ras基因家族與人類腫瘤相關的基因有三種——H-ras、K-ras和N-ras，分別定位在11、12和1號染色體上。其中，K-Ras則對人類癌症影響最大，它好像 分子開關 ：當正常時能控制調控細胞生長的路徑；發生異常時，則導致細胞持續生長，並阻止細胞自我毀滅。
⑸ 信號通路研究思路
原文：信號通路研究思路_網路文庫 https://wenku..com/view/449d5a41ec3a87c24128c450
證明一個葯物能通過抑制P38表達而發揮保護細胞的作用，需要做的是：
要證明你的葯物是通過抑制P38表達而發揮保護作用，
首先 ，要證明P38表達增加會導致損傷。
其次，要證明你的葯物存在保護作用。
再次，證明你的葯物可以抑制P38表達。
最後，證明你的葯物是由於抑制了P38表達而發揮保護作用。
這里需要建立一個損傷模型。正如你提到的，鈣離子導致P38mapk的增高，如果某種損傷可以通過鈣離子導致P38mapk的增高，那麼你就建立起了一個損傷模型。這時，對P38做個RNA干擾，使其表達下降，再來損傷刺激，如果這時損傷刺激不會導致損傷，那麼可以說P38mapk的增高會導致損傷。
這里最好不要用P38的抑制劑SB來處理，因為這個抑制劑是針對P38活性的抑制劑，抑制的是P38的磷酸化，而不是表達量。
如果說明的問題是p38磷酸化水平增加而導致損傷，那麼我建議用抑制劑。這時還可以用Dominant-negative。抑制劑的實驗證實該葯物不影響P38表達，而影響其活化。（應該首先考慮選用抑制劑，因為目前一些葯物的作用機制不是抑制靶點的表達，而是抑制靶點的激活。如果在此應用RNAi的話，很可能會漏掉這個機制或增加實驗步驟。）
當然就是用你的葯物先處理一下，再來損傷刺激，如果這時損傷刺激不會導致損傷，那麼可以說你的葯物存在保護作用。
用你的葯物先處理一下，再來損傷刺激，再檢測P38表達，如果用葯組相對於沒有用葯組P38表達下降，那麼可以說你的葯物可以抑制P38表達。
這一步看似不必要，其實是最重要的步驟，而國內的文章往往忽略了這一關鍵環節。
這里建議還是用RNA干擾P38表達，再用你的葯物處理，再進行損傷刺激，如果用葯組與沒有用葯組的損傷程度一致，那麼才可以說你的葯物是由於抑制了P38表達而發揮保護作用。
抑制劑也有其局限性，有時是「致命」的，主要原因是抑制劑缺乏特異性。雖然我們在文章里看到用抑制劑的時候都說是什麼什麼的特異性抑制劑，但真的那麼特異嗎？其實往往是作者為了寫文章發文章的需要而誇大了抑制劑的特異性。細胞里無數的信號通路，誰也不能保證抑制劑在作用於靶分子時不會影響其他信號通路。其實無論什麼抑制劑，對劑量的要求都相對比較苛刻，為什麼？就是因為一旦濃度高了，就不知道會干擾到其他哪些信號通路，從而產生很多說不清道不明的現象。
PI3K的抑制劑---LY294002和wortmannin,它們都能抑制PI3K和相關的激酶，但LY294002的濃度達到200μM常用來抑制DNA依賴的蛋白激酶（DNA-PK）；wortmannin在濃度超過3μM常用來抑制運動失調性毛細血管擴張基因突變（ATM)以及DNA-PK。相對而言，MEK1/2的抑制劑U0126和PD98059以及P38MAPK的抑制劑SB203580就要好一些。所以研究人員一般應用LY294002時採用20μM，應用wortmannin時採用0.2μM，以此來最小化其他的效應。有些學者們同時應用兩種抑制劑進行對比，也許也有顧及於此的原因吧。
但是，從嚴謹的角度講起特異性的話，RNAi也不能說是絕對特異的，我們只能說它是高特異性，因為RNAi的機制中還有很多沒有完全闡明。 一些研究者會在RNAi處理後，還要在實驗中應用Western來同時檢測該蛋白所在家族的其他成員的表達量變化以檢測其特異性和選擇性，以表嚴謹 。舉個例子：
比如針對Survivin進行RNAi之後，你最好同時檢測XIAP , cIAP1/2等蛋白。當然，如果你所針對基因的siRNA構建已經很成熟，有前人的文章檢測特異性做基礎，那就另當別論了，所以給科研態度很嚴謹的lwjssry兄弟提個醒，如果你的siRNA序列尚無很好的文獻應用基礎，這個問題你也許應該考慮的。
臨時找到一個描訴相關內容的06年文獻，影響因子3分多，截取其中的內容供參考
信號通路有細胞特異性和條件特異性，即同一信號通路在不同的細胞之間或同一細胞在不同的條件下，作用機理可能是不同的。
細胞內的信號通路之間存在復雜的相互作用，想證明哪一個分子是另一分子的充要條件真的很難。本人最近研究了一個信號系統的兩個信號分子，A和B。A在細胞質，B在細胞核。以往的研究已經證明A是B的上游信號通路之一。我們的研究是想證明在某種病理過程中A和B作為一個系統發揮作用。我們首先應用能夠提升該系統的葯物干預，發現A升高的同時B也得到升高，但這也不能說明什麼問題。所幸的是A分子目前有特異性的阻斷劑，於是我們便對A分子的激活進行阻斷，結果發現B分子的激活也收到抑制。由此初步推測A和B可能在某種病理過程中作為一個系統發揮作用。但也只能證明了A是B的必要條件而已。
做信號傳導的在於你研究一種的機制有什麼作用，其機制是否於信號傳導有關，有哪些關系，是什麼原因導致此信號傳導的表達，表達後的下游基因怎麼變化，這中間最好有基因敲出或者抑制劑和激動劑干預後看看上游 下游之間的變化和你預期的結果有沒有關系。如果單純的做信號傳導而去做沒有什麼意義的，就像前面樓上說的一樣信號的啟動/最終發揮功能！
「想證明哪一個分子是另一分子的充要條件真的很難」。 我最近正在做一個實驗，證明A對B的作用。先用外源物處理細胞，跑wetern blot，發現A和B都有所增加，B的量增加在A之後。於是用抑制劑抑制A，以及用siRNA使A knockdown，然後看B的表達量也下來了。但是這也只能證明A和B有關聯，無法證明A對B是直接作用還是間接作用。甚至無法說明B的改變是A信號knockdown造成的，還是A信號knockdown以後，細胞為了彌補該信號的不足，補充促進了C信號，而C信號可以改變B信號。最近在考慮用Co-IP證明A和B有結合作用，也許能證明A和B的直接關系。
探討信號轉導中分子間的充要條件，與探討數學中的充要條件是不一樣的，因為細胞中信號轉導通路往往存在反饋機制。即使X是上游信號，Y是下游信號，改變Y信號也會通過反饋機制使得X信號發生改變。所以，在考慮生物體內的信號分子間充要條件時會復雜得多，要慎之又慎下結論。
信號分子的環路效應普遍存在
個人覺得研究A分子與某個信號通路應該更具體得分為兩種情況：
1，以前還不知道A分子是這個信號通路的成分，這時我們要證明A分子是這個信號通路的成分，這時的研究就是上文談到的研究內容了。
2，A分子是信號通路的成分，這是已知的，現在發現某個現象跟這個通路有關，現在我們要證明A分子是這個信號通路參與這個現象的關鍵分子，則又是另一種模式。1，「創造信號通路」，別人沒有研究過A和B 之間的相互作用，而你發現了，並證明了，這就是創造，其實准確點說應該是「發現」，因為信號通路是客觀存在的，只不過被找到了而已，不過用「創造」這個詞比較形象。這一類的研究是開創性的，比較困難的，研究的時候常常是用免疫共沉澱去把與某個蛋白結合的一堆蛋白都搞出來，再做質譜分析，進行鑒定，再進一步證明兩者間的相互作用，這就涉及到充分必要條件的證明。單純進行這一類的研究缺乏目的性和研究的意義，所以通常還是建立於某種現象基礎上的，用自己「創造」的信號通路來解釋某種現象，也就是下面說的第二種模式。
2，「利用信號通路」，利用別人或自己「創造」的信號通路來解釋某個具體的現象，比如，某個葯物、某種毒物、某種應激、某種射線、等等，在這些刺激下，具體到某種細胞的某條信號通路發揮調控作用。
在第一類中，是用充分必要條件來證實A分子與B分子的作用。
在第二類中，是用充分必要條件來證實A現象與B信號通路之間的關系。
看文獻是最基礎的訓練，看文獻，一是看思路，二是學技術和邏輯思維。思路告訴我們為什麼去做，技術和邏輯思維教我們怎麼去做。
過表達A基因，發現B基因的mRNA水平明顯增加，對應的B的蛋白水平也明顯增加；干擾A基因表達，發現B基因的mRNA水平明顯降低，對應的B的蛋白水平也明顯降低。投稿，被拒稿，主要原因是審稿人提出：應該弄清楚A是如何調控B的表達的。請問各位老師，A調控B可能是通過什麼途徑？需要做什麼實驗？A和B都是脂類代謝中的酶基因，它們在胞漿和核內都有表達。
回答：
1、下一步應該搞清楚B基因mRNA改變的原因是什麼，在轉錄水平還是影響了RNA的穩定性。
2、假設A和B是直接關聯的（假定A影響B的轉錄），是否一般得做兩個實驗：Luciferase reporter assay和CHIP assay？只做一個CHIP實驗行不行？其中Luciferase reporter assay是否就是為了檢驗A蛋白是否能結合到B基因的Promoter區？是不是A蛋白必須得是轉錄因子才有可能結合到B基因的Promoter區？另外，怎麼知道A蛋白是不是轉錄因子呢？
針對這個問題的回答：不過建議找幾篇JBC上的文章看看，JBC上這種調調的文章挺多的，精讀3-5篇，把它的outline搞清楚，你就胸有成竹了。——我打開JBC網站一看，呵呵，每期專門有Gene Regulation板塊。根據JBC上面的文章，A調控B基因，很多都是通過第三者如轉錄因子實現的。我再翻出以前自己的Real-time PCR實驗結果，發現過表達A基因後，轉錄因子C的mRNA水平顯著增加，而干擾A基因表達，轉錄因子C的mRNA水平顯著降低。目前這個現象還沒有文獻報道。後期，我准備通過Luciferase reporter assay和CHIP assay來驗證轉錄因子C是否能與B基因作用。我想請教的問題是：A基因調控轉錄因子C，除了前期的Real-time PCR實驗（當然再補一個Western Blot實驗），我還需要做其他實驗嗎？會不會審稿人再提出：你需要弄清楚A基因如何調控轉錄因子C才行。說簡單點：A基因通過轉錄因子C調控基因B，是否要將A影響C，C影響B兩步都弄清楚？——看你的目標雜志了，如果是JBC這樣偏機制的，估計會要你說清楚的
3、A可以影響B的mRNA水平，也能影響B的蛋白水平，這樣的話，可能是只通過影響B的RNA水平影響B的蛋白表達，也可能同時影響B的RNA水平和B的蛋白穩定性。B的蛋白穩定性你可以通過加入CHX檢測B的半衰期。另外就是你說的Luciferase reporter assay實驗。
4、A和B的變化總是一致的，應該很有可能是通過轉錄水平調控的，因為你的mRNA、蛋白都變了。既然是轉錄水平，那就要找到B的啟動子的序列，對應和這個序列結合的蛋白，這個蛋白可能是A也可能是其他的間接的。
http://..com/question/187327495.html
將兩種因子A和B分別做基因沉默，沉默A gene 看看A和B表達的情況，然後沉默B gene 再看看A和B表達的情況。上游的因子被沉默表達後，下游的因子肯定表達下調或不表達。而下游因子被沉默表達後，上游因子的表達不會受影響。還可以做個免疫共沉澱，看看上游因子是不是直接結合（作用）於下游因子的基因啟動子區，開啟下游表達。如若不是，可能另有其他的環節在中間過程。
http://www.helixnet.cn/bbs/thread-19295-1-1.html
《受體信號轉導研究方法（第2版） 》
作者： （英）維拉斯（Willars，G.B.），（英）查理斯（Challiss，R.A.J）原著，
張幼怡主譯
出 版 社： 北京大學醫學出版社
出版時間： 2008-3-1 <wbr>
這本書全面反映了G蛋白偶聯受體(GPCR)及其信號轉導領域中最新的研究現狀和成就，詳細介紹了受體及其信號轉導研究的技術、方法及原理。內容涉及受體與配體的結合、受體抗體的制備、受體與G蛋白的相互作用和激動、受體表達和定位、受體內化和翻譯後修飾、GPCR與蛋白質相互作用以及如何利用敲除和敲人策略研究受體生理與葯理功能等新技術、新策略。
可以通過對受體 加抗體處理 或者 RNAi/過表達 等方式，調節受體表達量，然後用 基因晶元技術 研究下游通路各基因的表達情況。
在上述方法做完後，可以用受體的好用的抗體，做個免疫共沉澱(CoIP)，將所有和它相互作用的蛋白抓下來，直接煮珠子(protein A-argrose-beads)，做SDS-PAGE，用IgG做對照，然後打質譜，鑒定出差異蛋白，當然這只是補充試驗，膠圖上分子量大的可能是下游蛋白，而分子量小的可能是上下游信號蛋白。
⑹ western blot 研究未知的信號通路的大致步驟 或者給篇信號通路研究的經典文獻也行，fxw0110/ 163.com
有人的歌哈特
⑺ 信號轉導和信號通路有什麼區別
【1】信號轉導更大一點，包括分子結構調節、活性調節、蛋白表達等等。信號通路是信號轉導的具體過程，從上游到下游。
【2】信號：信號是數據的電磁編碼或電子編碼。和數據一樣，信號也分為模擬信號和數字信號。模擬信號是指電信號的參量是連續取值的，其特點是幅度連續。常見的模擬信號有電話、傳真和電視信號等。數字信號是離散的，從一個值到另一個值的改變是瞬時的，就像開啟和關閉電源一樣。數字信號的特點是幅度被限制在有限個數值之內。常見的數字信號有電報符號、數字數據等。信號是運載消息的工具，是消息的載體。從廣義上講，它包含光信號、聲信號和電信號等。
⑻ reactom 和kegg信號通路哪個更權威
KEGG好像是個資料庫吧！程序或軟體我還沒聽說過，我搞競賽那會兒都是用實驗方法，我當年全國競賽實驗考試就是限定時間內降解一個娃哈哈礦泉水瓶！
⑼ 怎麼一次下載kegg資料庫中的全部通路數據
kegg 中的通路怎麼運用到基因
這個只是皮毛介紹一下KEGG，具體操作還要自己摸索的，用文字不好描述，我還是會一點的，就是先將基因的序列下載下來，上傳到KEGG，KEGG會將基因的信號通路網址信息發到你郵箱里，你就可以看到你的目的基因在那些信號通路里有，我有篇這方面的文章發在蠶業科學上，不過剛接受
最簡單，但是未必最有效的辦法，但是最快 抽個樣本，把你的目標基因打上標記，然後建立一個模型，比如決策樹等等 模型質量不錯的情況下跑全庫，然後找出分類結果為你目標分類的記錄
⑽ 基因信號通路中DNA一個圓圈是什麼意思
——>o——> 轉錄激活
——>e——>也是促進基因表達