Ⅰ pcr實驗步驟詳細
一、 樣品RNA的抽提
1. 取凍存已裂解的細胞，室溫放置5分鍾使其完全溶解。
2. 兩相分離 每1 ml的TRIZOL試劑裂解的樣品中加入0.2 ml的，蓋緊管蓋。手動劇烈振盪管體15秒後，15到30℃孵育2到3分鍾。4℃下12 000 rpm離心15分鍾。離心後混合液體將分為下層的紅色酚相，中間層以及無色水相上層。RNA全部被分配於水相中。水相上層的體積大約是勻漿時加入的TRIZOL試劑的60%。
3. RNA沉澱 將水相上層轉移到一干凈無RNA酶的離心管中。加等體積異丙醇混合以沉澱其中的RNA，混勻後15到30℃孵育10分鍾後，於4℃下12 000 rpm 離心10分鍾。此時離心前不可見的RNA沉澱將在管底部和側壁上形成膠狀沉澱塊。
4. RNA清洗 移去上清液，每1 mlTRIZOL試劑裂解的樣品中加入至少1 ml的75%乙醇（75%乙醇用DEPCH2O配製），清洗RNA沉澱。混勻後，4℃下7 000 rpm離心5分鍾。
5. RNA乾燥 小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉澱在室溫空氣中乾燥5-10分鍾。
6. 溶解RNA沉澱 溶解RNA時，先加入無RNA酶的水40μl用槍反復吹打幾次，使其完全溶解，獲得的RNA溶液保存於-80℃待用。
Ⅱ PCR模板為基因組DNA，一引物兩側有30bp反向互補序列，如何調整PCR程序
不在引物上，應該沒啥問題。如果PCR產物特異性差，建議適當提高退火溫度或者換用保真度高的酶。
如果非要認為模板特殊結構有影響的話，不妨試著調整一下PCR
緩沖液的成分，針對不同的結構有專用緩沖液。
祝樓主好運！
Ⅲ pcr儀使用時，在設定反應程序時，一共分了多少個步驟
1．常規程序
將PCR反應所需的成分配置完後，在PCR儀上於94-96℃預加熱幾十秒至幾分鍾，使模板DNA充分變性，然後進入擴增循環。在每一個循環中，先於94℃保持30秒鍾使模板變性，然後將溫度降到復性溫度（一般50-60℃之間），一般保持30秒鍾，使引物與模板充分退火；在72℃保持1分鍾（擴增1kb片段），使引物在模板上延伸，合成DNA，完成一個循環。重復這樣的循環25～35次，使擴增的DNA片段大量累積。最後，在72℃保持3-7min，使產物延伸完整，4℃保存。
2．復性（退火）和延伸溫度
復性的溫度是PCR擴增是否順利的關鍵因素，通常在50-60℃之間。具體的溫度主要由引物的Tm值決定。延伸溫度絕大多數設定為72℃。如果復性的溫度很高，可以將延伸溫度和復性溫度設置成同一溫度，變成二步法PCR。
3．反應時間
變性步驟一般使用30秒鍾，如果模板的G+C含量較高，或直接用細胞做模板，變性時間可適當延長。復性時間有30秒種一般是足夠的。延伸時間由擴增產物的大小決定，一般採用1kb用1分鍾來保證充足的時間。
4．循環次數
循環次數主要與模板的起始數量有關，在模板拷貝數為104～105數量級時，循環數通常為25～35次。
平台效應（plateaueffect）：PCR擴增過程後期會出現的產物的積累按減弱的指數速率增長的現象。原因：底物和引物的濃度已經降低，dNTP和DNA聚合酶的穩定性或活性降低，產生的焦磷酸會出現末端產物抑製作用，非特異性產物或引物的二聚體出現非特異性競爭作用，擴增產物自身復性，高濃度擴增產物變性不徹底。
5．PCR反應液的配製
PCR反應體系的配置方式有時也會影響反應的正常進行。常規方法與其它酶學反應一樣，在最後加入DNA聚合酶。早期的PCR儀沒有帶加熱的蓋子，要求在反應液上覆蓋一層礦物油，防止水分蒸發。
對於使用具3』-5』外切活性的高溫DNA聚合酶時，有時會擴增不出產物。在遇到這個問題時，如果將反應成分分開配製，A管含模板、引物和dNTP，以及調整體積的H2O，B管含緩沖液、DNA聚合酶和水，然後再將兩管溶液混合起來，可較好地克服這個問題。
按照常規的方法配製反應體系，有時會出現非特異性擴增的問題。熱啟動（hotstart）PCR操作方式可較好解決這一問題。將dNTP、緩沖液，Mg2+和primer先配製好，然後加入一粒蠟珠（如AmpliWaxPCRQam100），加熱熔化，再冷卻，使蠟將溶液封住，最後加入模板和DNA聚合酶等剩餘成分。只有當PCR反應進入高溫階段後，蠟層熔化，所有反應成分才會混合在一起。
Ⅳ 簡述PCR技術操作步驟
PCR即聚合酶鏈式反應（Polymerase chain reaction）的縮寫，它是體外酶促合成特異DNA片段的方法。這一方法的要點是合成兩個分別互補於待擴增DNA片段兩端的小片段引物，在含有引物、待擴增DNA模板核苷酸底物和DNA多聚酶的反應體系中DNA復制反復進行，在短時間內可以取得大量擴增產物。其原理是寡聚核苷酸鏈引物在DNA聚合酶的作用下沿模板延伸，合成兩個與靶DNA兩側序列互補的引物，在體外進行靶DNA的重復合成。
主要的技術步驟是：
（1）DNA變性 加熱使靶DNA序列雙鏈解離成單鏈DNA。
（2）引物與靶DNA退火 適當降低溫度，使兩個引物分別結合成靶DNA兩條的3′末端向5′末端延伸。
（3）引物延伸 在DNA聚合酶的催化下，引物沿著靶DNA3′末端向5′末端延伸。新合成的DNA鏈在變性解離後，又可作為模板與引物雜交，並且在DNA聚合酶的催化下，引導合成新的靶DNA鏈。如此反復進行以上3個步驟，即可使靶DNA片段指數性擴增。
Ⅳ PCR引物GC含量過低時候,如何調整PCR體系
!gyesang(站內聯系TA)你PCR的模板是什麼?你做PCR的目的是什麼?設計引物的時候,上下游引物的GC含量相差盡量 不要太大,你接下來可以試下touchdown.意孤城_(站內聯系TA)如果不想麻煩就touchdown PCR,如果求穩當設置梯度PCR,溫度上下限時你兩條引物的溫度cicelyzh(站內聯系TA)一般GC含量低的話把引物序列設計稍微長一點,就可以補償Tm低的問題.你說的百分比差別也不是那麼大.如果兩個引物的tm不同,按照低的考慮PCR的退火溫度.加酶切位點的引物的Tm需要按照不包含酶切位點的序列計算.xikexiao(站內聯系TA)GC含量最好在50%以上比較好,不然退火溫度達不到,建議重新設計引物scilencing(站內聯系TA)試試梯度PCR的策略
Ⅵ 兩步法pcr程序設定
一步法,使用特殊引物,全程只設置一個溫度即可完成擴增.這種特殊引物有專利.
二步法即循環擴增中設置2個步驟,這個方法主要擴增短片段,一個是95度變性,另一個是退火與擴增的溫度,一般設置在55~60之間,當然也有例外.
三步法就是平常見到的方法,擴增循環有三步,變性,退火,延伸.
Ⅶ PCR配液過程中正確的操作是什麼
PCR操作流程：
1. 從冰箱取出所需試劑、樣品，放置在冰盒上，解凍試劑、樣品，點動離心。 2. 取所需數量小EP管（200 μl），按附錄所示配製反應體系。 3. 加完所有試劑和樣品後，點動離心，去除管內氣泡。 4. 在PCR儀上設定合適參數，具體見儀器操作手冊。參數設置完成後，將反應管放入PCR儀內小EP管位，根據所用EP管調整熱蓋位置，蓋緊上蓋。 5. 啟動程序，做好記錄。 6. 完成後及時取出反應管，關閉儀器。 7. 用0.5×TBE配製瓊脂糖膠，100 V，電泳15-25 min，紫外燈下觀察條帶，必要時拍照記錄。 注意事項： 1. 節約試劑，所有試劑使用前都應點動離心；若為探索條件或鑒定試驗，推薦25 μl反應體系。 2. 含酶試劑應盡量保持低溫，從冰箱取出解凍後，應盡量放在冰盒裡，每次吸完後也應放回冰盒。 3. 加試劑及樣品應按順序進行，模板應在最後加入；自加引物開始，每次吸樣前都必須更換吸頭。 4. 注意移液器正確使用，吸取或排出微量液體時，應注意保證吸取或加入量的准確性。 5. 加完所有試劑後去氣泡應徹底。 6. 及時記錄儀器使用及狀況。 7. 瓊脂糖膠濃度可根據目的條帶大小做適當調整。
附：PCR常用反應體系 如所用試劑為Takara ExTaq/rTaq試劑，則反應體系如下（50 μl）： ddH2O 35.5/34.5 μl 10*Buffer 5 μl 2.5mM dNTPS 4 μl 引物1 2 μl 引物2 2 μl Taq酶 0.5 μl 模板 1/2 μl 如所用試劑為Mix則反應體系如下（50 μl）： ddH2O 20/19 μl 2*Mix 25 μl 引物1 2 μl 引物2 2 μl 模板 1/2 μl 註：反應體系可按比例調整；斜杠後的體系為菌液PCR體系；若使用Takara試劑，菌液PCR使用rTaq酶，其餘樣本使用ExTaq酶，反應中使用的其它試劑相同。
Ⅷ PCR的完整操作步驟是什麼
首先在PCR儀中設定程序：一般是94度變性5min，之後「94度變性、退火（不同引物溫度不同）、72度」延伸共30-35個循環，再72度延伸10min，最後hold16度即可。反應體系一般有20微升或50微升，由上下游引物、buffer、dNTP、模板、Taq酶和水等組成，配好後放入PCR儀中按設定程序進行即可。
Ⅸ PCR儀如何設置
1、按 PCR 儀正面左下角電源開關，啟動 PCR 儀。
2、放 PCR 離心管，先把頂蓋向上扳，再往前推，露出放樣孔，PCR 管
放入前應加好反應體系各組分，再放入 PCR 離心管。
3、反向重復第二步驟將頂蓋板向後拉，蓋好頂蓋。
4、按 F2「Create」新建一個擴增的 PCR 程序。
5、按控制檯面右方上下左右方向鍵，可隨意移動編輯位置，輸入需要
的溫度、時間、循環數等。
6、據 PCR 離心管中加入的反應體積總量，在「Reaction volume」後輸入
相應數值，有 Std「1～100ul」和 9600「1~50ul」兩檔可供選擇。
7、按 F1「Start」啟動
8、按「INFO」對應鍵查看 PCR 結束鍵。
9、擴增完成後按檯面左方「Stop」鍵退出。
10、按「Hist」，可查看上次擴增的歷史記錄。11、完全退出後，按檯面左下方電源開關，拔出插銷，切斷電源。
Ⅹ 上海pcr從30調到40
1、首先打開上海pcr應用程序主頁面。
2、在主頁面找到並且點擊pcr數值。
3、在彈出的頁面點擊更換數值。
4、將30調到40，點擊確定即可。